Siembra con asa de L

Autoclave

El autoclave es un aparato que se emplea para obtener materiales estériles (que deben resistir altas temperaturas) y para esterilizar material desechable contaminado previamente a su eliminación. En este caso trabajamos con el autoclave RAYPA STERICLAV-75.

El aparato genera calor húmedo, en forma de vapor de agua a presión, y la esterilización se consigue a través del mecanismo de la coagulación de las proteínas, destruyendo así todo tipo de microorganismos, incluyendo los virus y las esporas.

Muestra de agua de peptona para esterilizar

Autoclave en funcionamiento

Habitualmente, el autoclave consta de los siguientes elementos:

• Fuente de calor (eléctrica o de gas).
• Interruptor general que enciende y apaga el aparato.
• Volante que permite la apertura y cierre de la tapa.
• Depósito con resistencia eléctrica en el fondo.
• Rejilla perforada que se sitúa a la mitad del depósito.
• Cestillo para poner el material y que se sitúa encima de la rejilla.
• Manómetro indicador de la presión interna y termómetro que indica la temperatura.
• Llave de desvaporización o purga.
• Válvula de vapor o presión y válvula de seguridad.

Por otro lado, a la hora de poner en marcha el autoclave es necesario seguir estos pasos:

• Abrir la tapa girando el volante de cierre y desplazarla con el brazo.
• Llenar el depósito con agua destilada hasta la señal por debajo de la rejilla perforada.
• Poner el material encima de la rejilla o en un cestillo, de forma que queden espacios entre los materiales para que circule correctamente el vapor de agua.
• No taponar el orificio superior del depósito por donde sale el vapor de agua para esterilizar los materiales.
• Desplazar la tapa para que cierre el depósito hasta el tope y girar el volante de cierre para apretarla bien.
• Conectar el autoclave a la corriente eléctrica y accionar el interruptor general.
• El autoclave irá aumentando la temperatura y empezará a producir vapor de agua, que desplaza al aire. Una vez purgado el aire del interior, se cierra la llave de purga y la temperatura que se alcanza en ese momento es de 100ºC, momento en el que la presión comienza a subir hasta 1 atmósfera y la veremos indicada en el manómetro.
• Cuando se alcanzan la temperatura y presión deseadas es cuando comienza el tiempo de esterilización, durante el cual se eliminan todos los microorganismos, incluidos virus y esporas.
• Finalmente, cuando termina el tiempo de esterilización, se desconecta –de forma automática o bien manual–, con el interruptor, pero no se abrirá hasta que el manómetro indique 0 de presión y  se haya enfriado. Abrir la llave de desvaporización o de purga ayudará a que el vapor salga más rápido y descienda la presión.

Este sistema de esterilización tiene una serie de ventajas y desventajas. Así, entre las ventajas están que es la forma más rápida de esterilizar, no es tóxica, esteriliza gran variedad de materiales (vidrio, metal no oxidable, porcelana, goma y tela) y es económica.

Y entre las desventajas destaca el hecho de que hay materiales que no se pueden esterilizar con autoclave, como el plástico, sustancias insolubles en agua y material metálico oxidable, además de que solo esteriliza en superficie y no en profundidad.

Las condiciones idóneas de esterilización pueden ser las siguientes:

• 120ºC y 1 atmósfera de presión, 20 min.
• 121ºC y 1 atmósfera de presión, 15 min.
• 134ºC y 2 atmósferas de presión, 10 min.
• 144ºC y 3 atmósferas de presión, 4 min.

MEDIO DE CULTIVO KLIGER EN TUBOS DE ENSAYO

- Objetivo:Realizacion de un medio de cultivo para la posterior siembra y realización de muestras para su observación al microscopio.

- Material de laboratorio necesario para la práctica: Microscopio electrónico, portaobjetos, cubreobjetos, asa de pica, mechero bunsen, pinza, agua destilada, medio de cultivo Kliger, placa calefactora, matraz Erlenmeyer, muestra de entero bacteria con E-coli, azul de metileno, tinción de Gram, tanita, lupa, tubo de ensayo.

- Procedimiento: En esta práctica lo que realizaremos es preparar un medio  de cultivo al igual que en la práctica anterior pero esta vez emplearemos el medio de cultivo Kliger iron Agar. Para realizar una preparación de 1 litro se necesitan 52 gr del medio de cultivo, por lo que para preparar 400 ml tenemos que pesar 20.8 gr.

Pesamos el medio de cultivo en la tanita y posteriormente lo mezclamos en un matraz Erlenmeyer con ayuda de un imán. Lo calentamos hasta que alcanza la temperatura de ebullición. Y lo dejamos atemperar para preparar los tubos de ensayo.

Vertemos el medio de cultivo lentamente sobre el tubo verticalmente posicionado solo que lo dejamos posado en posición horizontal para que solidifique y podamos realizar la siembra en picadura.

Realizada la siembra lo metemos en la estufa de cultivo microbiológico durante 24 – 48 horas para que crezcan los microorganismos. Pasado el tiempo estipulado comprobamos os resultados y se observa que el medio Kliger ha cambiado de color, ahora se ha tornado amarillento y contiene gas en ambas partes del tuvo, por lo que deducimos de que es un E-coli gram – y tiene un PH ácido.

- Fotografías tomadas en clase de diferentes partes del procedimiento:

SIEMBRA MICROBIOLÓGICA

- Objetivo: Realizar cultivos y siembra de bacterias con diferentes métodos con los siguientes medios de cultivo: Maconkey y Estandar Metods de Agar. Para a posteriori realizar una observación al microscopio, previa preparación de muestras, de los resultados obtenidos.

- Material de laboratorio necesario para la práctica: Microscopio electrónico, placas de petry, portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra, mechero bunsen, pinza, agua destilada, medio de cultivo Maconkey, medio de cultivo Estandar Metods de Agar, placa calefactora, matraz Erlenmeyer, muestra de entero bacteria con E-coli, tubo con medio kliger, azul de metileno, tinción de Gram, tanita, lupa, asa de pica, tubo con medio kliger.

- Procedimiento: En primer lugar tenemos que preparar el medio de cultivo sobre el que después realizaremos las siembras:

   - Para Estandar de Agar se sabe que para preparar 1000 ml de disolución  se necesitan 23.5 gr del medio de cultivo Estándar de Agar, por lo que para preparar 400 ml se necesitan tomar 9.4 gr.

   - Para Maconkey se sabe que para preparar 1000 ml de disolución se necesitan 50 gr del medio de cultivo Maconkey, por lo que para preparar 400 ml se necesitan tomar 20 gr.

Pesamos ambas cantidades (por individual, ya que realizareos dos medios de cultivo diferentes) en una tanita y los diluimos en 400 ml de agua destilada con ayuda de un imán para que la mezcla sea lo más homogénea posible. Posteriormente calentamos la muestra en una placa calefactora hasta el punto de ebullición (100ºC) y una vez alcance esa temperatura lamantenemos durante 4 minutos. A posteriori dejamos que se atempere a temperatura ambiente el medio de cultivo, cuando ya se ecnuetre en la temperatura exacta está listo para emplacar  en las placas petry.

Una vez emplacado el medio de cultivo en las diferentes placas petry hay que esperar a que solidifiquen para que se puedan realizar las siembras con la muestra de enterobacteria E-coli.

Las siembras que realizamos son las siguientes:

   - Siembra en Zig-Zag.

   - Siembra en estría múltiple.

   - Siembra de cuatro cuadrantes.

   - Siembra según la técnica de los tres giros.

Realizamos también una siembra en un tubo con medio kliger con ayuda de un asa de pica; se realiza una picadura en el medio del medio del tubo, se saca y se realiza siembra en zigzag sobre el medio inclinado del tubo.

Realizadas las siembras las introducimos en la máquina de cultivo microbiológico y las dejamos a una temperatura adecuada de 24 a 48 horas.

A los dos días observamos las placas en las que ha habido crecimiento bacteriano para visualizarlo con mayor facilidad utilizamos una lupa de laboratorio, se observa que el crecimiento microbiano es mayor en el momento en que el asa tocó por primera vez el cultivo y a medida  que avanzamos progresivamente el crecimiento microbiano y las colonias son menores. En las placas en las que si ha habido crecimiento microbiano tomamos una muestra con el asa de siembra de alguna de las colonias de la placa y las empleamos para hacer diferentes muestras sobre las que realizaremos diferentes métodos de tinción; tinción con azul de metileno y tinción de Gram.

- Observaciones: En el caso del tubo con medio Kliger, se puede ver que tras la siembra de microorganismos una vez ha crecido la bacteria sobre el medio, este ha cambiado de color rojo a amarillo en todo el tubo, por lo que sabemos que ha fermentado glucosa y lactosa. En la parte inferior del tubo hay aire por lo que ha habido una acumulación de gas, el PH que tiene es ácido. 

- Fotografías tomadas en clase de diferentes partes del procedimiento:

- Muestra de enterobacteria E-coli de la que cogemos la muestra para realizar las siembras:

- Ejemplos de las siembras:

- Tinción de Gram:

- Observación del cambio de color del medio de cultivo Kliger:

- Observación al microscopio de le muestra de enterobacteria sembrada:

Dilución decimal con yogur

- Objetivo:

Lo que se pretende con esta práctica es realizar una dilución primaria cuya finalidad es lograr una muestra representativa del alimento, en el caso de esta práctica de yogur Kéfir o activia, para hacer una distribución totalmente uniforme de los microorganismos contenidos en la muestra.

- Material de laboratorio necesario para la práctica: Pipeta, kéfir, yogur activia, Stomacher, agua destilada, matraz Erlenmeyer, tubos de ensayo, pera de goma.

- Procedimiento: 

Para realizar la práctica emplearemos unos diluyentes para favorecer la recuperación de los microorganismos presentes y ponerlos de manifiesto cuando se cultiven.

Para lograrlo el diluyente debe tener una osmolaridad y PH favorables para su recuperación. Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen y esto se logra realizando diluciones decimales seriadas en el mismo diluyente, para lograrlo se comienza con las diluciones.

Preparamos una disolución madre, para ello tomaremos 5g de yogur.

1/10 = 5g de muestra /x  à  50g . 50g totales – 5g de muestra = 45g de diluyente necesitamos añadir a la muestra

Se disuelve la muestra con 45g (ml) de agua destilada y  lo mezclamos en el Stomacher. La mezcla obtenida del Stomacher se pone en el matraz Erlenmeyer para poder tomar la muestra.

Ponemos en cada tubo de ensayo  9ml de agua destilada y comenzamos con las diluciones decimales: En el primero ponemos 1ml de la disolución madre para completar los 10 ml de preparación. Dicho tubo de ensayo se agita para mezclarla y una vez agitado ponemos 1 ml de este primer tubo de ensayo en el siguiente y agitamos la nueva preparación. Una vez agitado el tubo numero 2 volvemos a realizar la misma operación con el número 3 y 4, obteniendo así una serie de diluciones decimales en las que la presencia de la disolución madre está cada vez más diluida. Una vez terminadas las diluciones decimales se colocan en la gradilla y se meten a la estufa de cultivo microbiológico.

- Fotografías tomadas en clase de diferentes partes del procedimiento:

-Material de laboratorio:

-Diferentes fotografías del proceso:

Tinción de Gram+ y Gram-

- Objetivo: 

Observación al microscopio de bacterias Gram + y Gram – mediante el empleo de una muestra de enterobacterias y otra muestra de E-Coli.

- Material de laboratorio necesario para la práctica: 

Microscopio, alcohol-acetona, lugol, safarina, violeta cristal oxalato, pipeta pasteur, placa petry, agua destilada, portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra, mechero, pinza.

- Procedimiento: 

En primer lugar debemos realizar los frotos de las dos bacterias por individual para su posterior observación, utilizamos el asa de siembra la cual esterilizamos con ayuda de un mechero para recoger de la placa petry cada una de las bacterias y depositarlas en dos portaobjetos individuales. En segundo lugar nos ayudamos del meche para fijar la muestra al portaobjetos con calor. Una vez se haya fijado correctamente teñimos las muestras con cada colorante y reactivo por individual y lo dejamos reposar unos minutos para que la tinción se realice correctamente. Tras haber esperado con ayuda de agua destilada retiramos el sobrante de colorante de cada una de las muestras y volvemos a esperar unos minutos para que se seque el frotis. Una vez que se ha secado ya podemos proceder a su observación al microscopio. Apreciamos que las bacterias Gram – poseen un color rojo-rosaceo y pertenecen a las enterobacterias y que las bacterias Gram + poseen un color azulado- violeta mas oscuro y se corresponde con las bacterias de la muestra de E-Coli.

- Fotografías tomadas en clase de diferentes partes del procedimiento:

-Placas petry con las bacterias:

- Material necesario para la práctica:

- Recogida con el asa de siembra de la bacteria:

- Fijación con el mechero de la bacteria al portaobjetos:

- Tinción y secado de los frotis:

- Observación al microscopio:

Coprinus comatus y Ganoderma applanatum

- Objetivo: Observación de coprinus comatus y de Ganoderma applanatum al microscopio.

- Material de laboratorio necesario para la práctica: Copinus comatus, microscopio, estereoscopio, ganoderma applanatum, placa petry, agua destilada, navaja, portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra.

- Procedimiento: Previamente necesitamos depositar unos trozos que cortaremos con una navaja del coprinus comatus en una placa petry y dejaremos reposar esa muestra durante 24 horas. El motivo es porque el coprinus comatus tiene unas esporas que se convierten en un líquido negro (muy similar a la tinta) y es lo que observaremos al microscopio. El ganoderma applanatum lo observamos al estereoscopio y diferenciamos su sombrero escamoso asi como las numerosas láminas que lo componen y su pie cilíndrico.

- Fotografías tomadas en clase de diferentes partes del procedimiento: 

- Coprinus comatus:

- Ganoderma applanatum:

- Observación al microscopio de esporas de coprinus comatus:

- Esporas líquidas de coprinus comatus en placa petry: